- Introduzione alla diagnosi di laboratorio della malattia infettiva
- Microscopia
- Coltura
- Prove di sensibilità
- Test immunologici per malattie infettive
- Metodi di identificazione non basati sugli acidi nucleici per malattie infettive
- Metodi di identificazione per le malattie infettive basati sugli acidi nucleici
Risorse sull’argomento
La coltura prevede la crescita del germe in un terreno nutritivo liquido o solido; l'aumento del numero di microrganismi semplifica l'identificazione. La coltura facilita anche le prove di sensibilità agli antibiotici.
La comunicazione con il laboratorio è fondamentale. Nonostante la maggior parte dei campioni venga seminata su terreni standard (p. es., agar sangue o cioccolato), alcuni patogeni richiedono l'addizione di nutrienti e inibitori specifici (vedi tabella Terreni selettivi per l'isolamento di batteri comuni) o di altre condizioni speciali per l'incubazione (p. es., temperatura specifica, concentrazione di ossigeno o di diossido di carbonio, o durata). Se si sospetta uno di questi patogeni più esigenti o se il paziente ha assunto antimicrobici, il laboratorio deve essere avvisato. Si segnala la fonte del campione in modo che il laboratorio possa differenziare i patogeni dalla normale flora specifica della sede in questione.
Terreni selettivi per l'isolamento di batteri comuni
Microrganismo | Mezzo preferito |
|---|---|
Bacteroides spp | Kanamicina-vancomicina agar sangue laccato |
Bacteroides fragilis | Bacteroides bile-esculina (con gentamicina e bile) |
Agar di Bordet-Gengou con meticillina o cefalexina Agar cefalexina di Regan-Lowe Sangue di cavallo agar carbone | |
Burkholderia cepacia agar | |
Campylobacter jejuni o C. coli | Agar Campylobacter-selettivi (p. es., cefoperazone vancomicina-agar) |
Tinsdale agar Agar sangue cistina-tellurite Terreno di Löffler con siero coagulato | |
Escherichia coli o patogeni enteroemorragici (produttori di tossina Shiga, tra cui O157-H7) | Agar MacConkey sorbitolo |
Agar cistina-sangue o cistina-cioccolato | |
Legionella spp | Agar con estratto di lievito tamponato con carbone |
Terreno di Fletcher o di Stuart con siero di coniglio o terreno per Leptospira con albumina bovina-Tween 80 | |
Agar di Lowenstein-Jensen | |
Modified Thayer-Martin agar New York City agar | |
Salmonella e Shigella spp | Possono crescere su MacConkey standard o su eosina-blu di metilene Alternative: hektoen o agar xilosio-lisina-desossicolato per Salmonella-Shigella e Gram-negativi oppure brodo arricchito alla selenite |
Vibrio spp | Agar sucroso-tiosolfato-sali biliari-citrato-tiosolfato |
Yersinia spp | Cefsulodin-irgasan novobiocina-agar |
Raccolta del campione
La raccolta del campione è importante. Per la diagnosi di malattie infettive, la regola generale è il campione in cui l'infezione è presente. Nelle lesioni cutanee devono essere campionati i bordi, non il centro.
L'uso di tamponi è sconsigliato. Tuttavia, se viene utilizzato un tampone, è preferibile utilizzare un tampone floccato perché può recuperare più campione. I tamponi utilizzati per le analisi molecolari devono essere compatibili con lo specifico saggio molecolare per cui sono destinati. Un tipo di tampone non adatto può produrre risultati falsi negativi. I tamponi con manico di legno sono tossici per alcuni virus. I tamponi con punta di cotone sono tossici per alcuni batteri, comprese le clamidie.
Le emocolture richiedono la decontaminazione e la disinfezione della pelle (p. es., la pelle deve essere lavata con soluzione a base di alcol isopropilico al 70% in combinazione con clorexidina gluconato e/o tintura di iodio) (1). Sono generalmente utilizzati campioni multipli, ciascuno prelevato da un sito differente; sono presi quasi contemporaneamente, se possibile, durante i picchi febbrili. La normale flora della cute che cresce soltanto in un singolo campione di sangue viene generalmente interpretata come contaminazione. Sfortunatamente, le emocolture sono spesso contaminate, con un rischio di esito negativo per il paziente e un costo sostanziale (2).
Se un campione di sangue viene prelevato da un catetere centrale, bisogna anche prelevare un campione di sangue periferico per poter meglio differenziare una batteriemia sistemica da un'infezione del catetere. Generalmente le colture da cateteri infetti si positivizzano più rapidamente e contengono più microrganismi rispetto alle emocolture periferiche prelevate simultaneamente. Alcuni funghi, in particolare muffe (p. es., Aspergillus spp), in genere non possono essere coltivate dal sangue.
Tutti i campioni devono essere trasportati rapidamente, nel terreno corretto e in condizioni che limitano la crescita della normale flora potenzialmente contaminante. Per un'accurata quantificazione del germe patogeno, bisogna impedire la crescita di patogeni addizionali; i campioni devono essere trasportati immediatamente in laboratorio o, se si ritarda il trasporto, refrigerati (nella maggior parte dei casi).
Riferimenti
1. CLSI. Principles and Procedures for Blood Cultures. 2nd ed. CLSI guideline M47. Clinical and Laboratory Standards Institute; 2022.
2. Doern GV, Carroll KC, Diekema DJ, et al. Practical Guidance for Clinical Microbiology Laboratories: A Comprehensive Update on the Problem of Blood Culture Contamination and a Discussion of Methods for Addressing the Problem. Clin Microbiol Rev. 2019;33(1):e00009-19. Published 2019 Oct 30. doi:10.1128/CMR.00009-19
Considerazioni speciali per le colture
Alcune colture meritano considerazioni speciali.
Anaerobi
I batteri anaerobi non devono essere coltivati dalle sedi in cui costituiscono parte della flora normale perché può essere impossibile differenziare i patogeni dalla flora normale. Bisogna evitare il contatto dei campioni con l'aria, e ciò può risultare difficile.
Per i campioni su tampone, sono disponibili mezzi di trasporto anaerobi. Tuttavia, campioni di liquidi (p. es., contenuti di ascessi) sono migliori dei campioni su tampone per il recupero di batteri anaerobi. I campioni di liquidi devono essere raccolti con una siringa da cui è stata espulsa tutta l'aria (per minimizzare il contatto del campione con l'ossigeno) e inviati a un laboratorio nella siringa (chiusa senza ago) o trasferiti a una fiala per il trasporto anaerobico.
Micobatteri
I micobatteri sono difficili da coltivare. I campioni contenenti la normale flora (p. es., espettorato) devono essere prima decontaminati e concentrati.
Il Mycobacterium tuberculosis e altri micobatteri crescono lentamente. La crescita di M. tuberculosis è in genere più veloce nel liquido che in mezzi solidi; l'uso di routine di sistemi automatizzati con liquidi può comportare la crescita entro 2 settimane versus ≥ 4 settimane su supporti solidi come Lowenstein-Jensen agar. Inoltre, in un campione possono essere presenti pochi microrganismi. Il campionamento multiplo dalla stessa sede può contribuire a massimizzare i risultati. I campioni devono essere lasciati crescere per 8 settimane prima di essere scartati. Il M. ulcerans, che causa l'ulcera di Buruli, richiede fino a 12 settimane a 32° C su agar Lowenstein-Jensen.
Qualora si sospetti un micobatterio atipico, il laboratorio deve essere informato del sospetto diagnostico.
Virus
I virus vengono generalmente coltivati da tamponi e campioni di tessuto. Essi sono spesso trasportati in mezzi contenenti sostanze antibatteriche e antifungine.
I campioni vengono inoculati all'interno di colture tissutali che supportano il virus sospetto e inibiscono tutti gli altri microbi. I virus altamente labili (p. es., varicella zoster) vanno inoculati in coltura entro 1 h dalla raccolta. Le colture tissutali standard sono più sensibili. La tecnica di coltura rapida, in cui il campione viene centrifugato su un monostrato cellulare all'interno di una fiala, fornisce risultati più rapidi (2 giorni contro 7 a 14 giorni).
Alcuni virus comuni non possono essere riconosciuti attraverso i metodi di coltura comuni e richiedono metodi alternativi per la diagnosi. Inoltre, molti laboratori clinici non eseguono più colture virali. I metodi basati sugli acidi nucleici hanno sostituito la coltura virale per la maggior parte dei virus comuni (vedi tabella Test diagnostici per alcuni patogeni virali), come per i seguenti:
Test immunoenzimatico per l'Epstein-Barr virus, per i virus dell'epatite B, i virus dell'epatite E, per l'HIV, e per il virus T-linfotropico dell'uomo
Test sierologici per i virus dell'epatite A e virus dell'epatite D
Metodi basati sugli acidi nucleici per HIV, influenza, virus respiratorio sinciziale (RSV), SARS-CoV2
Funghi
I campioni di miceti ottenuti da siti non sterili devono essere inoculati in terreni che contengono sostanze antibatteriche. I campioni devono essere lasciati crescere per 3-4 settimane prima di essere considerati negativi e scartati.
