Microscopia

DiMaria T. Vazquez-Pertejo, MD, FACP, Wellington Regional Medical Center;
Larry M. Bush, MD, FACP, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University
Revisionato/Rivisto gen 2025
Visualizzazione l’educazione dei pazienti

L'esame al microscopio del tessuto può essere richiesto per distinguere la malattia invasiva da colonizzazione di superficie, una distinzione non facile da realizzare con i metodi di coltura.

La maggior parte dei campioni viene trattata con colorazioni che evidenziano i patogeni, facendoli risaltare dallo sfondo, inoltre possono essere utilizzate esami a fresco di campioni non colorati per identificare miceti e alcuni altri patogeni.

Il medico richiede una colorazione sulla base dei patogeni probabili. Tuttavia, nessuna colorazione è specifica al 100% (ossia, diversi microrganismi possono colorarsi in modo simile). La maggior parte dei campioni viene trattata con la colorazione di Gram e, se si sospetta la presenza di micobatteri, con una colorazione acidoresistente. Tuttavia, alcuni patogeni non sono facilmente visibili utilizzando tali colorazioni; se si sospettano questi agenti patogeni, sono necessarie altre colorazioni o altre metodiche di identificazione.

Siccome l'identificazione microscopica richiede solitamente una concentrazione microbica di almeno 1 × 104-5/mL, la maggior parte dei campioni di liquidi biologici (p. es., liquido cerebrospinale) vengono concentrati (p. es., per centrifugazione) prima di essere esaminati.

L'indagine microscopica ottica può essere eseguita velocemente, ma la sua accuratezza dipende dall'esperienza del microscopista e dalla qualità dell'attrezzatura. Di regola si limita l'uso del microscopio a scopo diagnostico da parte del clinico all'esterno di un laboratorio certificato.

Colorazione di Gram

La colorazione di Gram effettua quanto segue:

  • Classifica i batteri in base alla loro capacità di ritenere o meno il colorante cristal-violetto (Gram-positivo, colore blu) (Gram-negativo, colore rosso)

  • Mette in risalto la morfologia cellulare (p. es., bacilli, cocchi) e la disposizione cellulare (p. es., grappoli, catene, doppiette)

  • Identifica i leucociti polimorfonucleati, indicando un'infezione batterica piuttosto che una colonizzazione

Tali caratteristiche possono orientare la terapia antibiotica in attesa dell'identificazione definitiva. Trovare una miscela di microrganismi con diverse morfologie e caratteristiche di colorazione per la colorazione di Gram suggerisce una contaminazione del campione o un'infezione polimicrobica. Trovare molte cellule squamose in un campione di escreato suggerisce che il campione è contaminato dalla saliva e quindi è di utilità diagnostica limitata.

Per eseguire una colorazione di Gram, i tecnici fissano il campione su un vetrino mediante il calore e lo colorano con l'esposizione sequenziale al cristal-violetto, allo iodio, al decolorante, e alla controcolorazione (di solito safranina).

Colorazione di Gram (Escherichia coli)
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Questa immagine è una micrografia ottica di E. coli colorati da Gram, batteri mobili, a forma di bastoncello. Il loro colore rosso indica che sono Gram-negativi. L'ingrandimento è 400X a una dimensione di 35 mm.
DR. ROSALIND KING/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Colorazione di Gram (Streptococcus pneumoniae)
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Questa immagine è una micrografia ottica con colorarzione di Gram di S. pneumoniae (noto anche come S. pneumococcus), sono batteri arrotondati (cocchi) che di solito si presentano in coppie e talvolta in catene corte. Il loro colore blu indica che sono Gram-positivi. L'ingrandimento è di 1450X quando viene stampato largo 10 cm.
CNRI/SCIENCE PHOTO LIBRARY

Colorazioni acido-resistenti e acido-resistenti modificate

Queste colorazioni sono usate per identificare i seguenti:

Nonostante l'individuazione dei micobatteri nell'espettorato richieda la presenza di almeno 10 000 microrganismi/mL, essi sono spesso presenti a concentrazioni inferiori, così la sensibilità è scarsa. Solitamente, alcuni mL di espettorato sono decontaminati con idrossido di sodio e concentrati mediante centrifugazione per la colorazione acidoresistente. La specificità è migliore, ma alcuni microrganismi moderatamente acidoresistenti sono difficilmente distinguibili dai micobatteri.

Colorazione acidoresistente (Mycobacterium tuberculosis)
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Questa immagine è una micrografia ottica con colorazione acidoresistente di un campione di espettorato contenente batteri M. tuberculosis. Il colore rosso che rimane dopo il trattamento con alcol acido indica che sono acidoresistenti.
CDC/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Colorazione di Ziehl-Neelsen (Mycobacterium leprae)
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Questa immagine è una micrografia ottica con colorazione modificata di Ziehl-Neelsen (colorazione di Wade-Fite) di M. leprae in una biopsia cutanea da una persona con lebbra lepromatosa. I micobatteri appaiono rossi e sono presenti in gran numero, sia singolarmente che in gruppi (globi). L'ingrandimento è 20X quando è stampato a 10 cm di larghezza.
WEBPATHOLOGY/SCIENCE PHOTO LIBRARY

Colorazioni fluorescenti

Le colorazioni fluorescenti permettono l'identificazione a concentrazioni più basse (< 1 × 104 cellule/mL). Esempi sono

  • Arancio di acridina (batteri e funghi)

  • Auramina-rodamina e auramina O (micobatteri)

  • Bianco calcofluoro (funghi, specialmente dermatofiti)

L'associazione di un colorante fluorescente a un anticorpo diretto contro un patogeno (immunofluorescenza diretta o indiretta) aumenta teoricamente la sensibilità e la specificità. Tuttavia, questi test sono difficili da leggere e interpretare, e pochi (p. es., test anticorpi a fluorescenza diretta per Pneumocystis e Legionella) sono disponibili in commercio e comunemente utilizzati.

Colorazione fluorescente (Pneumocystis jirovecii)
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Questa immagine è una colorazione con anticorpi a immunofluorescenza diretta utilizzando anticorpi monoclonali che hanno come bersaglio P. jirovecii in un campione di lavaggio broncoalveolare di una persona con un cancro.
CDC/Immagine cortesia di Brigham & Women's Hospital, Boston, MA

Preparati a fresco

I preparati a fresco di campioni non colorati possono essere utilizzati per rilevare quanto segue tramite microscopia a campo scuro:

La visibilità dei funghi può essere aumentata mediante applicazione di idrossido di potassio (KOH) al 10% per sciogliere i tessuti circostanti e microrganismi non fungali.

Preparato a fresco (normale)
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L'esame del preparato a fresco usando la soluzione fisiologica mostra grandi cellule epiteliali vaginali nucleate, piccoli batteri appena visibili e globuli bianchi di dimensioni intermedie. L'ingrandimento è 400X.
By permission of the publisher. From Hillier S. In Atlas of Infectious Diseases: Sexually Transmitted Diseases. Edited by G Mandell (series editor) and MF Rein. Philadelphia, Current Medicine, 1996.

Colorazione all'inchiostro di china

La colorazione con inchiostro di china (carbone colloidale) viene utilizzata per rilevare principalmente Cryptococcus neoformans e altri funghi incapsulati in una sospensione cellulare (p. es., sedimento del liquido cerebrospinale). Viene colorato sia lo sfondo che il microrganismo stesso, in tal modo viene resa visibile la capsula intorno ad esso, la quale appare come un alone. Nel liquido cerebrospinale, il test non è così sensibile come l'antigene criptococcico. Anche la specificità è limitata; i leucociti possono apparire capsulati.

Colorazione con inchiostro di China (Cryptococcus neoformans...
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Questa immagine è una micrografia ottica colorata con inchiostro di China C. neoformans. La colorazione con inchiostro di China rende le capsule intorno ai microrganismi visibili sotto forme di un alone (anello luminoso).
CDC/Brinkman/SCIENCE PHOTO LIBRARY

Colorazione di Warthin-Starry e Dieterle

Queste colorazioni con l'argento sono utilizzate per visualizzare batteri come

Colorazione di Warthin-Starry (Bartonella henselae)
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Questa immagine mostra una micrografia ottica di una colorazione di Warthin-Starry argentica del batterio B. henselae. Con la colorazione di Warthin-Starry, appaiono come piccoli microrganismi curvi neri singolarmente o in gruppi come al centro della micrografia. Di solito si trovano in aree di necrosi e nei vasi sanguigni.
WEBPATHOLOGY/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Colorazione di Warthin-Starry (Borrelia burgdorferi)
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Questa immagine è una micrografia ottica con colorazione di Warthin-Starry di batteri B. burgdorferi (frecce) in un campione di tessuto cardiaco.
CDC/Sherif Zaki, M.D. Ph.D.; DVBD/SCIENCE PHOTO LIBRARY

Colorazione di Wright e di Giemsa

Queste colorazioni sono usate per identificare i seguenti:

Colorazione di Wright-Giemsa dello striscio di sangue periferico
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Le colorazioni di Wright-Giemsa sono miscele di coloranti basici (blu di metilene) che colorano di blu e di coloranti acidi (eosina) che colorano di rosso. Pertanto, i componenti acidi della cellula (nucleo, RNA citoplasmatico, granuli basofili) si colorano di blu o di viola e i componenti basici della cellula (emoglobina, granuli eosinofili) si colorano di rosso o di arancione.
By permission of the publisher. Da Tefferi A, Li C. In Atlas of Clinical Hematology. Edited by JO Armitage. Philadelphia, Current Medicine, 2004.

Colorazione tricromica (colorazione di Gomori-Wheatley) e colorazione con ematossilina ferrica

Queste colorazioni sono usate per identificare i protozoi intestinali.

La colorazione di Gomori-Wheatley viene utilizzata per individuare i microsporidi. Può non rilevare uova e le larve di elminti e non identificare in modo affidabile il Cryptosporidium. I funghi e le cellule umane assorbono il colorante.

L'ematossilina ferrica colora in modo differenziale le cellule, le inclusioni cellulari e i nuclei. Le uova di elminti possono assumere una colorazione troppo scura per consentirne l'identificazione.

Colorazione tricromica (Blastocistis spp)
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Questa immagine mostra specie di Blastocystis colorate con tricromia.
Image from the Centers for Disease Control and Prevention, Global Health, Division of Parasitic Diseases and Malaria.
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