Métodos baseados em ácidos nucleicos são utilizados para detectar sequências específicas de DNA ou RNA extraídas do microrganismo. As sequências podem ou não ser amplificadas in vitro.
A identificação (molecular) com ácido nucleico tornou-se comum na prática clínica; a identificação rápida resultante permite que o paciente inicie o tratamento antimicrobiano específico e evita o tratamento prolongado com fármacos empíricos potencialmente inapropriados.
Métodos baseados em ácidos nucleicos são geralmente específicos e altamente sensíveis, podendo ser utilizados para todas as categorias de microrganismos. Os resultados podem ser obtidos rapidamente. Os médicos devem conhecer as possibilidades diagnósticas e solicitar os testes adequados, pois cada teste é específico para um organismo único.
Avanços recentes levaram ao desenvolvimento de ensaios multiplex, em que um único teste baseado em ácido nucleico pode detectar e diferenciar entre ≥ 2 microrganismos causadores. Ensaios multiplex estão atualmente disponíveis para detectar agentes de guerra biológica e certos patógenos respiratórios, entéricos ou neurotrópicos. Esses ensaios abrangem um painel de patógenos virais e não virais e são solicitados em resposta a uma síndrome clínica, como sintomas respiratórios, gastrointestinais ou de meningoencefalite. Ensaios multiplex têm sensibilidade e especificidade semelhantes aos de ensaios com um único alvo, mas são essencialmente qualitativos e podem ser mais difíceis de interpretar em um paciente específico.
Os testes baseados em ácidos nucleicos são qualitativos, mas métodos quantitativos existem para um número atualmente limitado, porém crescente, de infecções (p. ex., hepatite B, hepatite C, HIV, citomegalovírus, vírus linfotrópico T humano); esses métodos podem ser úteis para diagnóstico e para monitoramento da resposta ao tratamento.
Teste não amplificado
Técnicas que têm por alvo sequências de ácido nucleico, mas não exigem amplificação dessas sequências, geralmente se limitam a situações em que o organismo foi primeiro cultivado ou está presente em alta concentração na amostra (p. ex., a faringite causada por Streptococcus do grupo A, infecções genitais causadas por Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae).
Amplificação de ácido nucleico
Técnicas de amplificação do ácido nucleico (NAAT) utilizam quantidades mínimas de DNA ou RNA e os replicam muitas vezes, o que propicia a detecção de traços de um microrganismo em uma espécie, evitando a necessidade de cultura. Essas técnicas são particularmente úteis para organismos que são de difícil cultivo ou identificação pelo uso de outros métodos (p. ex., vírus, patógenos intracelulares obrigatórios, fungos, micobactérias, algumas outras bactérias) ou se estiverem presentes em pequeno número.
Esses testes podem ser
Amplificação do alvo [p. ex.,reação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR)], amplificação do deslocamento da fita, amplificação da transcrição]
Amplificação do sinal (p. ex., ensaios de DNA ramificado, captura híbrida)
Amplificação por sonda (p. ex., reação em cadeia da ligase, clivagem do invasor e sondas de ciclagem)
Análise pós-amplificação (p. ex., sequenciamento do produto amplificado, análise de microarray e análise da curva de fusão, como é feito na PCR em tempo real)
É fundamental a coleta e o armazenamento adequados de amostras antes de chegar ao laboratório de diagnóstico molecular. Resultados falso-positivos de contaminações mínimas do amostras ou do equipamento podem ocorrer facilmente, pois os métodos de amplificação são muito sensíveis.
Apesar da alta sensibilidade, resultados falso-negativos ocorrem algumas vezes, mesmo quando um paciente é sintomático (p. ex., infecção pelo vírus West Nile). Resultados falso-negativos podem ser minimizados desta maneira:
Evitar o uso de swabs com hastes de madeira ou pontas de algodão (o swab que foi validado para ensaio de amplificação deve ser utilizado)
Transportar as amostras rapidamente
Congelar ou refrigerar as amostras caso o transporte demore > 2 horas
O congelamento é o método mais utilizado para as amostras de amplificação do ácido nucleico. Porém, as amostras devem ser refrigeradas em vez de congeladas se houver suspeita de vírus lábeis (p. ex., varicela-zóster, influenza, HIV-2), ou se também forem feitas culturas virais (as amostras congeladas podem não servir para as culturas convencionais).
