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Microscopia

PorMaria T. Vazquez-Pertejo, MD, FACP, Wellington Regional Medical Center;
Larry M. Bush, MD, FACP, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University
Reviewed ByBrenda L. Tesini, MD, University of Rochester School of Medicine and Dentistry
Revisado/Corrigido: jan. 2025
Visão Educação para o paciente

Recursos do assunto

O exame microscópico do tecido pode ser necessário para distinguir doença invasiva de colonização de superfície—a distinção não é facilmente alcançada por métodos de cultura.

A maioria das amostras é corada com substâncias que identificam os patógenos, diferenciando-os do meio pela cor, embora amostras a fresco não coradas possam ser utilizadas para detectar fungos e alguns parasitas.

Os médicos solicitam colorações com base nos prováveis patógenos. Entretanto, nenhuma coloração é 100% específica (isto é, diferentes organismos podem corar de maneira similar). A maioria das amostras é tratada com coloração de Gram e, em caso de suspeita de micobactéria, com coloração álcool-ácido resistente. Entretanto, alguns patógenos não são facilmente visíveis com essas colorações; se esses organismos forem suspeitos, colorações diferentes ou outros métodos de identificação devem ser utilizados.

Como a detecção por microscopia geralmente requer uma concentração microbiana de pelo menos 1 × 104-5/mL, a maioria das amostras de líquidos fisioógicos (p. ex., líquido cefalorraquidiano) são concentradas (p. ex., por centrifugação) antes de fazer o exame.

A microscopia óptica pode ser realizada rapidamente, mas a acurácia depende da experiência do microscopista e da qualidade do equipamento. Regulamentos muitas vezes limitam os médicos quanto ao uso de microscópio para propósitos diagnósticos em laboratórios não certificados.

Coloração de Gram

A coloração de Gram:

  • Classifica as bactérias de acordo com a retenção dos cristais de cor violeta (Gram-positivo — cor azul) ou não (Gram-negativo — cor vermelha)

  • Evidencia a morfologia celular (p. ex., bacilo ou coco) e os arranjos celulares (p. ex., isolados, em cadeias ou em duplas)

  • Identifica leucócitos polimorfonucleares, indicando infecção bacteriana em vez de colonização

Essas características podem orientar a terapia antibiótica, enquanto se aguarda a identificação definitiva. Encontrar uma mistura de microrganismos com várias morfologias e diferentes características pela coloração de Gram sugere amostra contaminada ou infecção bacteriana polimicrobiana. Encontrar muitas células escamosas em uma amostra de escarro sugere que a amostra está contaminada por saliva e, portanto, sua utilidade diagnóstica é limitada.

Para realizar a coloração de Gram, a amostra é fixada por calor a uma lâmina e corado por exposição sequencial ao cristal violeta do Gram, a iodo, a descolorante e contracoloração (tipicamente, safranina).

Coloração de Gram (Escherichia coli)
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Essa imagem é uma micrografia óptica de bactérias E. coli móveis, em forma de bastonete, Gram-coradas. A cor vermelha indica que são Gram-negativas. Ampliação é 400X em filme de 35 mm.
DR. ROSALIND KING/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Coloração de Gram (Streptococcus pneumoniae)
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Essa imagem é uma micrografia óptica de bactérias S. pneumoniae arredondadas (cocos) Gram-coradas (também conhecidas como S. pneumococcus), que são geralmente encontradas em pares e, às vezes, em cadeias curtas. A cor azul indica que são Gram-positivas. A ampliação é de 1450X quando impressa com 10 cm de largura.
CNRI/SCIENCE PHOTO LIBRARY

Coloração álcool-ácido resistente e álcool-ácido modificada

Essas colorações são utilizadas para identificar:

Embora a detecção de micobactérias em escarros necessite pelo menos 10.000 organismos/mL, as micobactérias estão, na maioria das vezes, presentes em níveis menores, de forma que a sensibilidade é limitada. Em geral, alguns mL de escarro são descontaminados com hidróxido de sódio e concentrados por centrifugação para coloração álcool-ácido resistente. A especificidade é maior, embora alguns microrganismos moderadamente álcool-ácido resistentes sejam de difícil distinção das micobactérias.

Coloração de álcool-ácido resistente (Mycobacterium tuberculosis...
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Essa imagem é uma micrografia óptica de uma amostra de escarro com coloração álcool-ácido resistente contendo bactérias M. tuberculosis. A coloração avermelhada remanescente após tratamento com álcool ácido indica que são álcool-ácido resistentes.
CDC/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Coloração de Ziehl-Neelsen (Mycobacterium leprae)
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Essa imagem é uma micrografia óptica de M. leprae com coloração de Ziehl-Neelsen modificada (coloração de Wade-Fite) em uma biópsia de pele de uma pessoa com hanseníase lepromatosa. As micobactérias têm aparência avermelhada e estão presentes em grande número, isoladamente e em aglomerados (globos). A ampliação é de 20X quando impressa em 10 cm de largura.
WEBPATHOLOGY/SCIENCE PHOTO LIBRARY

Colorações fluorescentes

Os corantes fluorescentes permitem a detecção de concentrações menores (< 1 × 104 células/mL). Exemplos são

  • Laranja acridina (bactérias e fungos)

  • Auramina-rodamina e auramina O (micobactérias)

  • Calcofluor branco (fungos, especialmente dermatófitos)

Associando um corante fluorescente ao anticorpo de um patógeno (imunofluorescência direta ou indireta), teoricamente, a sensibilidade e a especificidade devem aumentar. Entretanto, a leitura e interpretação desses testes, e poucos (p. ex., testes de Pneumocystis e Legionella) testes fluorescentes diretos para anticorpos estão comercialmente disponíveis e são utilizados comumente.

Coloração fluorescente (Pneumocystis jirovecii)
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Essa imagem é uma coloração de anticorpos por imunofluorescência direta utilizando anticorpos monoclonais que têm como alvo P. jirovecii em uma amostra de lavado broncoalveolar de uma pessoa com câncer.
CDC/Imagem cedida por cortesia de Brigham & Women's Hospital, Boston, MA

Amostras a fresco

Amostras a fresco sem corantes podem ser utilizadas para detectar, via microscopia de campo escuro, os seguintes microrganismos:

Para aumentar a visibilidade dos fungos, hidróxido de potássio (KOH) a 10% pode ser aplicado para dissolver tecidos circundantes e organismos não fúngicos.

Exame a fresco (normal)
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O exame de montagem a fresco com soro fisiológico mostra grandes células epiteliais escamosas vaginais nucleadas, pequenas bactérias que são pouco visíveis e leucócitos de tamanho intermediário. Ampliação de 400X.
By permission of the publisher. From Hillier S. In Atlas of Infectious Diseases: Sexually Transmitted Diseases. Editado por G Mandell (editor da série) and MF Rein. Philadelphia, Current Medicine, 1996.

Coloração com tinta-da-índia

Utiliza-se coloração com nanquim (carbono coloidal) para detectar principalmente Cryptococcus neoformans e outros fungos encapsulados em uma suspensão de células (p. ex., sedimento do líquido cefalorraquidiano). O segundo plano, mais do que o próprio microrganismo, é corado, o que faz com que qualquer cápsula ao redor dele fique visível como um halo. No líquido cefalorraquidiano, o teste não é tão sensível quanto o antígeno criptocócico. A especificidade também é limitada; os leucócitos podem parecer encapsulados.

Coloração da Índia (Cryptococcus neoformans)
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Essa imagem é uma micrografia óptica de C. neoformans corada com nanquim. A coloração com nanquim torna as cápsulas ao redor dos organismos visíveis como um halo (círculo luminoso).
CDC/Brinkman/SCIENCE PHOTO LIBRARY

Coloração de Warthin-Starry e coloração de Dieterle

Essas colorações de prata são utilizadas para visualizar bactérias como

Coloração de Warthin-Starry (Bartonella henselae)
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Essa imagem mostra uma micrografia óptica de bactérias B. henselae com coloração prata de Warthin-Starry. Na coloração de Warthin-Starry, aparecem como pequenos microrganismos curvos em preto, isolados ou agrupados, como no centro da micrografia. Em geral, são encontradas em áreas de necrose e em vasos sanguíneos.
WEBPATHOLOGY/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Coloração de Warthin-Starry (Borrelia burgdorferi)
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Essa imagem é uma micrografia óptica de bactérias B. burgdorferi (setas) com coloração de Warthin-Starry em uma amostra de tecido cardíaco.
CDC/Sherif Zaki, M.D. Ph.D.; DVBD/SCIENCE PHOTO LIBRARY

Coloração de Wright e coloração de Giemsa

Essas colorações são utilizadas para detectar:

Coloração de Wright-Giemsa do esfregaço de sangue periférico
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As corantes de Wright-Giemsa são misturas de cores básicas (azul de metileno) que cora de azul e de corante ácido (eosina) que cora de vermelho. Assim, os componentes ácidos da célula (núcleo, RNA citoplasmático, grânulos basofílicos) se coram em azul ou púrpura, e os componentes básicos da célula (hemoglobina, grânulos eosinofílicos) se coram em vermelho ou laranja.
By permission of the publisher. From Tefferi A, Li C. In Atlas of Clinical Hematology. Edited by JO Armitage. Philadelphia, Current Medicine, 2004.

Coloração com tricrômio (coloração de Gomori-Wheatley) e coloração com hematoxilina férrica

São utilizadas para detectar protozoários intestinais.

A coloração de Gomori-Wheatley é utilizada para detectar microsporídios. A coloração de Gomori-Wheatley pode não dectetar ovos de helmintos e larvas e não identifica confiavelmente Cryptosporidium. Fungos e células humanas absorvem a coloração.

A coloração com hematoxilina férrica cora diferentemente células, inclusões e núcleos. A coloração para ovos de helmintos pode ser muito escura para permitir a identificação.

Coloração tricrômica (Blastocystis spp)
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Essa imagem mostra espécies Blastocystis coradas com tricrômio.
Image from the Centers for Disease Control and Prevention, Global Health, Division of Parasitic Diseases and Malaria.
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