Световая микроскопия может быть сделана быстро, но точность зависит от опыта работника лаборатории и качества оборудования. Инструкции часто ограничивают использование врачами микроскопии в диагностических целях вне сертифицированной лаборатории.
Может потребоваться микроскопическое исследование тканей, чтобы отличить инвазивное заболевание от поверхностной колонизации — это различие сложно установить с помощью метода культивирования.
Большинство образцов обрабатывают специальными красителями, которые окрашивают болезнетворные микроорганизмы, что позволяет выделить их на общем фоне, хотя для выявления грибов и некоторых других патогенов, также могут использоваться влажные препараты неокрашенных образцов.
Врач назначает проведение окрашивания, основанное на вероятных возбудителях. Тем не менее, никакое окрашивание не является на 100% специфичным (т.е., различные микроорганизмы могут окрашиваться одинаково). Большинство образцов обрабатывают окрашиванием по Граму, а если подозреваются микобактерии, то кислотостойким окрашиванием. Однако некоторые болезнетворные микроорганизмы нелегко увидеть при использовании этих методов, тогда в таких случаях требуются различные варианты окрашивания или другие методы идентификации.
Поскольку микроскопическое обнаружение обычно требует концентрации микробов по меньшей мере около 1 ×104-5/мл, большинство образцов биологической жидкости (например, спинномозговая жидкость) перед исследованием концентрируются (например, центрифугированием).
Окрашивание по Граму
Окрашивание по Граму обеспечивает следующее:
DR. ROSALIND KING/SCIENCE PHOTO LIBRARY
CNRI/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Классифицирует бактерии в соответствии с тем, дают ли они прочное соединение с кристаллвиолетом при окрашивании этим красителем или нет (грамположительные окрашиваются в синий цвет, грамотрицательные – в красный)
Позволяет определить морфологию клеток (например, бациллы, кокки) и их расположение относительно друг друга (например, скопления, цепочки, диплоиды)
Идентифицируют полиморфноядерные лейкоциты, указывая на бактериальную инфекцию, а не на колонизацию
Данные характерные черты микроорганизмов могут быть основанием для назначения той или иной антибактериальной терапии в период, предшествующий окончательной идентификации. После окраски по Граму обнаружение в образце смеси микроорганизмов с различными морфологическими характеристиками и окрашиванием предполагает зараженный образец или полимикробный характер бактериальной инфекции. Обнаружение большого количества плоскоклеточных клеток в образце мокроты позволяет предположить, что он загрязнен слюной и поэтому имеет ограниченную диагностическую ценность.
Для окрашивания по Граму лаборанты фиксируют материал образца на предметном стекле путем нагревания, а затем окрашивают его, последовательно обрабатывая образец кристаллическим фиолетовым красителем Грама, йодом, обесцвечивающим реагентом и контрастирующим красителем (как правило, сафранином).
Кислотостойкие и модифицированные кислотостойкие красители
Эти красители используются для идентификации следующих микроорганизмов:
CDC/SCIENCE PHOTO LIBRARY
WEBPATHOLOGY/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Кислотоустойчивые микроорганизмы (вид Mycobacterium spp)
Умеренно кислотоустойчивые организмы (в первую очередь вид Nocardia spp)
Rhodococcus и связанные с ним роды
Ооцисты некоторых паразитов (например, Cryptosporidium, microsporidia Cystoisospora [Isospora] belli, Cyclospora, Balantidium coli)
Хотя обнаружение микобактерий в мокроте требует не менее 10 000 микроорганизмов/мл, а микобактерии часто присутствуют в организме человека в меньших концентрациях, таким образом, чувствительность метода весьма ограничена. Обычно несколько мл мокроты дезактивируют гидроокисью натрия и концентрируют центрифугированием для кислотостойкого окрашивания. Это улучшает диагностику, хотя некоторые умеренно кислотостойкие организмы трудно отличить от микобактерий.
Флуоресцентное окрашивание
Флуоресцентное окрашивание позволяют обнаружить возбудителей при более низких концентрациях (< 1 × 104 клеток/мл). Примеры:
Акридиновый оранжевый (бактерии и грибы)
Аурамин-родамин и аурамин О (микобактерии)
Калькофлюор белый (грибы, особенно дерматофиты)
Соединение флуоресцентного красителя с антителом, направленным на болезнетворный микроорганизм (прямая или непрямая иммунофлюоресценция), увеличивает чувствительность и специфичность диагностики. Однако эти анализы трудно читать и интерпретировать, и немногие (например, прямые флуоресцентные анализы антител Pneumocystis и Legionella) коммерчески доступны и обычно используются.
Срезы нефиксированной ткани (влажные препараты)
Срез нефиксированной ткани неокрашенных образцов может быть использован с помощью темнопольной микроскопии для обнаружения следующего:
Паразиты (включая яйца гельминтов и личинки)
Вагинальные ключевые клетки (присутствующие при бактериальном вагинозе)
Подвижные организмы (например, трихомонады)
Спирохеты Treponema (присутствуют при сифилисе)
Обнаружение грибков может быть улучшено применением 10%-ной гидроокиси калия, чтобы растворить окружающие ткани и негрибковые организмы.
Окрашивание тушью (коллоидный углерод)
Окрашивающая тушь используется, чтобы обнаружить главным образом Cryptococcus neoformans и другие скрытые грибки во взвеси отмытых клеток (например, осадок спинномозговой жидкости). Окрашивается второстепенная область, а не организм непосредственно, что дает возможность увидеть любую капсулу вокруг организма как ореол. В спинномозговой жидкости тест не столь чувствителен, как при обнаружении криптококкового антигена. Специфичность метода также ограничена: лейкоциты могут казаться скрытыми возбудителями.
Серебрение по методам Вартин-Старри и Дитерле
Данное окрашивание используется для визуализации таких бактерий, как
WEBPATHOLOGY/SCIENCE PHOTO LIBRARY
CDC/Sherif Zaki, M.D. Ph.D.; DVBD/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Bartonella henselae (возбудитель болезни кошачьих царапин)
Окрашивание по Райту и Гимзе
Это окрашивание используется для обнаружения следующего:
By permission of the publisher. From Tefferi A, Li C. In Atlas of Clinical Hematology. Edited by JO Armitage. Philadelphia, Current Medicine, 2004.
Паразиты в крови
Histoplasma capsulatum в фагоцитах и клетках ткани
Внутриклеточные включения, образованные вирусами и хламидиями
Трофозоиты Pneumocystis jirovecii
Некоторые внутриклеточные бактерии
Трихромное окрашивание (окраска Гомори – Уитли) и окрашивание железным гематоксилином
Эти красители используются, чтобы обнаружить кишечных простейших.
Краситель Гомори – Уитли используется, чтобы обнаружить микроспоридии. Он может не выявить яйца гельминтов и их личинки; не всегда достоверно идентифицирует Cryptosporidium. Грибы и клетки человека также окрашиваются.
Железный гематоксилин дифференцированно окрашивает клетки, включения клеток и ядра. Яйца гельминтов могут окраситься в слишком темный цвет, что затрудняет идентификацию.
