Сбор и обработка образцов для микроскопической диагностики паразитарных инфекций

Кровь

Babesia spp

Толстый и тонкий мазки, как и на виды Plasmodium

Забор как и на Plasmodium spp

Применять окрашивание по Райту или Гимза.

Морфология похожа на кольцевые формы вида Plasmodium, но без пигмента и гаметоцит. Тетрады характерны для вида Babesia, но необязательны.

Толстые мазки крови могут быть сложны для интерпретации и должны выполняться только опытным микроскопистом.

Ворсинчатые черви

Толстая капля и тонкий мазок из 1 мл крови с предотвращением свёртываемости, если первый образец отрицательный, 5-10 мл концентрируют центрифугированием или фильтрацией

Микрофилярии Wuchereria bancrofti и Brugia malayi: брать кровь следует между 10 часами вечера и 2 часами утра.

Loa loa, Dipetalonema perstans, иMansonella ozzardi: брать кровь следует между 10 часами утра и 6 часами вечера.

Можно использовать красители Гимзы или гематоксилин-эозин напрямую или – для усиления чувствительности – после разведения образца в 2% растворе формалина (метод Кнотта) или после фильтрации через мембранный фильтр Nucleopore.

виды рода Plasmodium

Толстый и тонкий мазки капиллярной крови (т.е., из пальца или мочки уха, с использованием одноразового ланцета) или 5–10 мл свежей, предохранённой от свёртывания крови (предпочтительно в пробирках, содержащих ЭДТК)

Взять множественные образцы во время острого заболевания.

Подготовить мазки по капиллярной крови или крови с предотвращением от свёртывания в течение 3 часов после забора крови.

Применять окрашивание по Райту или Гимза.

Убедиться, что предметные стёкла чистые.

Виды Trypanosoma

Тонкие мазки капиллярной крови или 5-6 мл крови с предотвращением свертываемости

Следует провести забор капиллярной или антикоагулированной крови. Мазок на предметном стекле.

Для повышения чувствительности метода используются различные концентрационные методики.

Подвижные трипаносомы видны во влажных препаратах; окрашивание по Гимзе (или по Фильду) используется для идентификации трипаносом в фиксированных препаратах.

Костный мозг, другая ретикулоэндотелиальная ткань или цереброспинальную жидкость

Виды рода Leishmania (висцеральный лейшманиоз)

Аспират костного мозга, селезёнки, печени или лимфоузлов или мазки с лейкоцитной плёнки

Мазок на предметном стекле.

Применяют красители Гимза, Райт-Гимза или окраску гематоксилин-эозином.

Naegleria

Acanthamoeba

Balamuthia

Свежий образец спинномозговой жидкости

Применять методы асептического забора.

Исследовать образцы как можно быстрее.

Исследовать с применением световой или контрастной микроскопии.

Паразиты могут быть идентифицированы по движению; их можно фиксировать и окрашивать по Гимзе или выращивать в питательной среде.

Rhodesiense

Trypanosoma brucei gambiense

Аспират лимфатических узлов или шанкра

Свежий образец спинномозговой жидкости

Применять методы асептического забора.

Для определения подвижных паразитов применяют влажные препараты или же образцы фиксируют и окрашивают по Гимзе или по Филду до или после их концентрирования посредством центрифугирования.

Аспират двенадцатиперстной кишки или еюнальная биопсия

виды рода Giardia

Виды Cryptosporidium

Виды Cystoisospora

Виды Cyclospora

Микроспоридии

Виды Strongyloides (кишечной угрицы)

Аспират двенадцатиперстной кишки или биоптат тощей кишки

Следует незамедлительно провести исследование аспирата или выполнить его фиксацию и окрашивание. Необходимо провести гистопатологическое исследование материала биопсии.

Необходимо использовать влажный препарат с аспиратом для диагностики на яйца или личинки паразита Strongyloides. Для диагноза могут использоватся несколько видов окрашивания (подробную информацию смотрите ниже в разделе "Экскременты").

Основным методом обнаружения и видовой идентификации микроспоридий является трансмиссионная электронная микроскопия.

Ректальная биопсия

Schistosoma mansoni

Schistosoma japonicum

Образцы ректальной биопсии с уровня дорсальной складки (складка Хаустона), примерно 9 см от ануса

Зафиксировать на гистопатологию и выделить сегмент между слайдами на повышенную чувствительность.

Видообразование основано на морфологии зрелых яйцеклеток.

Ректосигмоидоскопия (проктоскопия)

Entamoeba histolytica

Соскоб с помощью кюретки или ложечки Фолькмана; образец слизистой, снятый хирургическим инструментом, или аспират из пораженных участков, взятый с помощью пипетки на 1 мл с резиновой грушей (ватные палочки не подходят)

Необходимо осмотреть образец сразу же или после фиксации и окрашивания.

Используют влажные или фиксированные окрашенные препараты (например, с трихромным красителем) для обнаружения трофозоитов и цист. Образцы стула анализируют на ДНК или наличие антигена к E. histolytica; эти анализы более чувствительны и могут отличать E. histolytica от E. dispair и других непатогенных амеб.

Кал

Виды Cryptosporidium

Множественные образцы свежего кала (≥ 3), собираемые ежедневно или через день

Свежие образцы охлаждают и изучают или хранят в формалине или другом фиксаторе.

Обращаться аккуратно, свежий кал и тот, который хранится в дихромате – заразный.

Для диагностики могут использоваться биопсия или аспират двенадцатиперстной кишки.

Влажные препараты необходимо изучать под обычным светом, дифференциальным интерференционным контрастом и иммунофлуоресцентной микроскопией.

Окрашивание образцов модифицированным методом по Цилю-Нильсену или с помощью модифицированного метода окрашивания сафранином. Анализ на фекальные антигены или ДНК более чувствительные.

Виды Cyclospora

Множественные образцы свежего кала, собираемые ежедневно или через день

Образцы следует охладить и изучить в свежем или замороженном виде или зафиксировать в 10%-ом формалине и 2,5%-ом дихромате калия. Разные лабораторные анализы требуют разных методов сохранения материала. Методы концентрации увеличивают чувствительность диагностики.

Исследовать влажные препараты обычным светом, дифференциальным интерференционным контрастом яркого поля и микроскопией в УФ-свете. Ооцисты аутофлуоресцентны при ультрафиолетовом свете. Фиксированные образцы могут быть окрашены модифицированным методом по Цилю-Нильсену или модифицированным методом окрашивания сафранином. Анализ споруляции может отличить представителей Cyclospora от сине-зеленых водорослей.

Анализ ДНК в кале является более специфическим и чувствительным.

Виды Cystoisospora

Множественные образцы свежего кала, собираемые ежедневно или через день

Свежевзятый материал изучают или хранят его в формалине или другом фиксаторе. Методы концентрации увеличивают чувствительность.

Ооцисты могут быть визуализированы во влажном препарате дифференциальным интерференционным контрастом яркого поля или эпифлуоресцентной микроскопией. Окрашивать зафиксированные образцы модифицированным кислотостойким красителем. Если результат анализа кала отрицательный, то диагностику можно осуществить с помощью аспирата из двенадцатиперстной кишки или образцов биопсии.

Entamoeba dispar

Entamoeba histolytica

Другие амебы

Многократный ежедневный забор образцов свежего кала (≥ 3), собранного утром

Исследовать несформированные или диарейные образцы в течение 15 минут.

Держать сформированные образцы в холодильнике до исследования. Хранят образцы в формалине или другом фиксаторе.

Используют влажные и фиксированные окрашенные (например, трихромным методом) препараты, а также методы концентрации цист.

Кал следует исследовать на ДНК или наличие специфического антигена E. histolytica, этот анализ является более чувствительным и способен отличить E. histolytica от E. dispar и других непатогенных амеб.

Enterobius spp

Яйца глистов, собранные с области вокруг ануса на липкую ленту и помещенные на предметное стекло

Взять образец в области вокруг ануса утром перед туалетом или принятием ванны.

При анализе Папаниколау яйца Enterobius иногда видны в образце кала или в содержимом влагалища. Взрослых гельминтов можно обнаружить в перианальной области или во влагалище.

виды рода Giardia

Несколько образцов свежего стула (≥ 3) берут утром через день

Свежевзятый материал изучают или хранят его в формалине или другом фиксаторе. Трофозоиты также могут быть обнаружены в аспирате двенадцатиперстной кишки.

Следует исследовать прямые и концентрированные образцы. Цисты обычно обнаруживаются во влажных препаратах, а трофозоиты – в фиксированных препаратах, окрашенных трихромом. Анализ на фекальные антигены или ДНК более чувствительные.

Микроспоридии

Множественные образцы свежего кала, собираемые ежедневно или через день

Может потребоваться биопсия тонкой кишки, если результат по калу отрицательный.

Обычно используются образцы, окрашенные хромотропным методом. Хемофлуоресцентные вещества, такие как калькофлуор, также могут применяться для быстрой идентификации.

Электронная микроскопия – наиболее чувствительный метод.

Анализы на ДНК в кале или ткани доступны для некоторых видов паразитарных червей.

Цестоды (ленточные черви)

Нематоды (круглые черви)

Ascaris

Нематоды

Strongyloides

Trichuris

Трематоды (сосальщики)

Другие

Ежедневный многократный забор образцов кала (не менее 7 образцов для обнаружения Strongyloides)

Образец охлаждают и изучают в свежем виде или фиксируют в 10%-ом формалине и концентрируют посредством осаждения в формалин-этил-ацетате.

Активные личинки выявляют у Strongyloides; выявление яиц возможно и в случае других кишечных гельминтов.

Если образцы стула хранятся при температуре окружающей среды, из яиц нематод могут вылупляться личинки, которые должны быть дифференцированы от личинок Strongyloides.

Когда имеется подозрение на инфицирование Strongyloides, а прямое обследование негативно, следует провести одно или несколько нижеследующих специализированных анализов кала: концентрация методом осаждения формалина-этилацетата, идентификация личинок методом воронки Берманна, культурирование с использованием метода фильтровальной пластинки Харада-Мори (Harada-Mori) или культурирование на агаровой пластине.

Мокрота или аспират респираторного тракта

виды рода Paragonimus

Свежая мокрота

Исследовать образец как можно раньше или законсервировать и хранить до более позднего исследования.

Могут понадобиться методы концентрации. Иногда яйца паразитов можно обнаружить в плевральной жидкости.

Strongyloides spp (гиперинфекция)

Мокрота, любой аспирируемый материал, жидкость, полученная при БАЛ, или дренажный материал

Исследовать образец как можно раньше или зафиксировать и держать до более позднего исследования.

Активные яйцеклетки можно увидеть во влажном препарате или их можно зафиксировать и окрашивать по Гимза.

Биопсия легких

виды рода Paragonimus

Открытая или перкутанная биопсия легкого, проводимая под контролем флуороскопии или КТ

Собранные образцы помещают в стерильный контейнер со стерильным соляным раствором. Фиксируют и окрашивают красителем Гимзы или гематоксилин-эозином.

Могут быть обнаружены яйца и взрослые трематоды.

Кожа

Leishmania spp Кожный лейшманиоз

Биопсия пораженного участка без признаков изъязвления и мазок-отпечаток или соскоб

Мазки-отпечатки, окрашенные по Гимзе, или соскобы и образцы биопсии, окрашенные гематоксилин-эозином, исследуют на предмет амастигот.

Амастиготы Leishmania морфологически неотличимы от амастигот Trypanosoma cruzi. Паразитов Leishmania можно культивировать из образцов кожи, взятых с помощью биопсии, однако их выращивание in vitro может занять несколько недель. Доступны молекулярные анализы на ДНК лейшмании.

Onchocerca volvulus

У пациентов, заражённых в Африке, берут образцы кожи с бедра, ягодиц или подвздошного гребня

У пациентов, инфицированных в Латинской Америке, образцы кожи берут с головы, лопатки или ягодиц

Для взятия образца, обработать место спиртом, ввести иглу №25 прямо под эпидермис, приподнять его и отделить маленький кусочек ткани скальпелем или бритвой или использовать в качестве инструмента склерокорнеальный перфоратор для биопсии. Кровотечения быть не должно. Изучают свежий материал или фиксируют его в метаноле и окрашивают красителем Гимзы или гематоксилин-эозином.

Образец, суспензированный в физиологическом растворе, исследуют на наличие подвижных микрофилярий, мигрировавших с образца кожи. Микрофилярии можно обнаружить на срезах тканей.

Секреты мочеполовой системы или биопсия

Schistosoma haematobium, иногда S. japonicum

Свежая моча или биопсия мочевого пузыря, в частности, области вокруг треугольника

Рекомендуемое время для сбора мочи – между 12 и 3 часами дня. Центрифугирование увеличивает вероятность обнаружения.

Яйца можно обнаружить во влажных препаратах с образцами мочи или в биопсийном материале из мочевого пузыря.

Trichomonas spp

Стерильные мазки секрета из влагалища, уретры или простаты помещают в пробирку с небольшим количеством стерильного солевого раствора

Предупредить пациентов женского пола не принимать душ 3-4 дня до забора образцов.

Отправить образцы в лабораторию как можно раньше.

Выявление подвижных организмов на влажном препарате – самый быстрый способ. Прямая реакция имуннофлуоресценции на наличие паразитов является более чувствительным методом; тест-культура – самый чувствительный способ, но занимает 3–7 дней. Доступны тесты амплификации нуклеиновых кислот.